一、实验技术流程
1、Total RNA的提取
1）取适量组织样品，在预冷的研钵中用液氮研成粉末，然后转入RNase free离心管中；
2）加入20mL的CTAB试剂，加入600μL巯基乙醇，振荡混匀，65℃静置30min充分裂解，每10min震荡一次；
3）加入4mL的氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5-10min；
4）8000×g，4℃，离心15-20min；
5）取上清至新RNase free离心管中，加入1/3体积5M氯化锂，颠倒混匀，4℃静置过夜；
6）12000×g，4℃，离心15min；
7）弃上清，加入5mL的75%乙醇（RNase free）洗涤沉淀，12000×g高速冷冻离心 5min；
8）重复步骤7）一次
9）弃上清，超净工作台中干燥RNA沉淀，然后溶解于适量DEPC水中。
2、mRNA分离
1）取上一步骤中提取的total RNA, 冰上融化放置；
2）取500μL Binding buffer B6（与RNA等体积）于65℃水浴预热；
3）小心用移液器轻轻混匀Fasttrack MAG beads, 吸取200μL beads到1.5mL RNase free离心管中；
4）将含有MAG beads的离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清（避免碰触MAG beads）；
5）将离心管从磁座上取下，马上加入500μL Wash buffer W7, 小心混匀；
6）将离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清（避免碰触MAG beads）；
7）重复步骤5）- 6）一次；
8）将离心管从磁座上取下，加入预热的Binding buffer B6和total RNA，小心混匀后65℃水浴孵育5min；
9）室温旋转颠倒混匀样品离心管10min；
10）将样品离心管放置在磁座上，静置1min，用移液器吸去上清；
11）重复步骤5）- 6）四次；
12）将洗涤过四次的Beads管从磁座上取下，加200μL DEPC水，小心混匀，37℃水浴2min；
13）将离心管放置在磁座上，静置1min，小心吸取上清至一个新的1.5mL离心管中（RNase free）；
14）重新在Beads管中加入100μL DEPC水，从磁座上取下，小心混匀后放置到磁座上；
15）静置1min后，小心吸取上清置于步骤13）的离心管中，将两次洗脱溶液合并，即样品的mRNA。
3、cDNA初级文库构建
1）片段和接头设计：参考参考《GATEWAY™ Cloning Technology》进行设计；
2）扩增引物设计；
3）cDNA第一链的合成；
4）cDNA第二链的合成；
5）cDNA adapter的制备；
6）cDNA与attB1重组接头连接（三份接头各连一份）；
7）cDNA分级分离；
8）BP重组；
9）电转化大肠杆菌DH10B；
10）文库克隆检测。
4、pGADT7酵母文库的构建
1）初级文库的质粒抽提；
2）文库质粒重组；
3）酵母文库质量鉴定。
a、库容量的鉴定；
b、重组率；
c、插入片段长度鉴定。
二、实验重难点
相比于SMART建库，Gateway建库对RNA起始量要求较高。
三、与其他同类型实验相比优势与劣势
酵母文库可以多次使用，同一物种的酵母文库可以用于不同的转基因筛选。不过对于亚细胞定位尚不明确的诱饵蛋白，需要明确其具体定位后，才能选择合适的酵母文库。
四、我司该实验业务优势
1、初始RNA量大，大大提高cDNA基因覆盖度；
2、分离mRNA为模板，可避免rRNA或残留基因组对一链合成的影响；
3、mRNA反转录，可获得完整的基因信息，避免冗余，避免了PCR扩增可能产生的基因偏好性；
4、Gateway重组法的高效性，较其它重组法优势非常明显；
5、Gateway文库可以重复使用次数是SMART技术10-20倍；
6、体外gateway重组后电转化大肠杆菌，更稳定，效率更高，而不是原始的以及线性化载体在大肠杆菌体内重组。
五、常见问题答疑
1、对于膜体系酵母文库和核体系酵母文库，该如何选择？
A：对于亚细胞定位显示定位在细胞核的蛋白，选择核体系文库；对于定位在细胞膜的蛋白，则选择膜体系文库；对于定位在细胞质的蛋白，可以选择核体系文库或膜体系文库。
2、膜体系酵母文库和核体系酵母文库在构建上有什么区别？
A：两者在初级文库构建上都是通过BP重组至pDONR222载体并电转化DH10B感受态；不过在次级文库构建上，核体系文库是通过LR重组至pGADT7-GW载体并电转化DH10B感受态，而膜体系文库是通过LR重组至pPR3-N载体并电转化DH10B感受态。
3、有关总RNA的吸光度各自代表什么？
A：260nm、340nm、230nm、280nm吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。
OD260/OD280体现了提取的RNA中蛋白质等有机物的污染程度。质量较好的RNA的OD260/OD280比值应该在1.8到2.2之间。如OD260/OD280小于1.8，则说明RNA中蛋白质等有机物的污染较多；如OD260/OD280大于2.2，则说明RNA已经降解成了单核苷酸。
OD260/OD230则体现了提取的RNA中盐离子或多糖的污染程度。质量较好的RNA的OD260/OD230比值应该在2.0左右。如OD260/OD230的比值小于1.0则说明RNA中仍残留大量多糖或盐离子污染。多糖的污染会影响OD260的吸收，从而导致RNA的浓度测定不准。残留的盐离子则可通过75%乙醇洗涤去除。